Texto escrito por Flora Cruz de Almeida
Técnica que amplifica uma sequência específica de DNA ( “faz cópias”) com o objetivo de torná-la abundante. Explora a capacidade de duplicação usando princípios básicos de replicação.
Permite a amplificação do DNA ou cDNA in vitro utilizando-se basicamente de uma reação enzimática catalizada pela polimerase (enzima termoestável, por isso a grande importância atribuída à alternância de temperatura - termociclos) cuja atividade depende de íons Mg2+ .
Primeiramente, adicionam-se todos os reagentes a uma máquina chamada termociclador. Eles são: primers, taq DNA polimerase, MgCl2 (estimulam a taq DNA polimerase) , tampão (mantém pH ótimo para enzima), água, DNA molde e dNTPs. Depois, são seguidas estas etapas: 1) “Melting”ou desnaturação: consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado; 2) “Annealing” ou anelamento ou hibridização: ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado; 3) “Extension” ou extensão: polimerização propriamente dita.
1)Desnaturação:94 ° C -96 ° C; Separa a fita dupla do DNA molde em duas fitas simples
2)Anelamento:37 ° C- 65 °C; Primers ligam-se aos sítios específicos na fita simples
3)Extensão:72 °; DNA polimerase acrescenta os dNTPs à fita, de acordo com o pareamento das bases
Inicialmente é necessário que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas. A elevação da temperatura entre 90 a 95 ºC promove a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples. Muitas vezes a temperatura de desnaturação é determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de guanina e citosina do fragmento de DNA alvo.
Os primers utilizados nessa etapa são pequenos fragmentos sintéticos de DNA de fita simples que são sintetizados in vitro baseado na sequência do DNA a ser amplificado sendo esses complementares à seqüência do segmento de DNA de interesse. Nas duas fitas surgem, assim, um pequeno fragmento de DNA de fita dupla intacta. Deve ser feito em temperatura inferior à de desnaturação ( 45 a 70 OC).
A patir dos primers, a DNA-polimerase liga os nucleotídeos entre si, completando assim as fitas simples e tornando-as duplas. A DNA-polimerase não reconhece apenas o bloco de início,mas também consegue diferenciar as duas extremidades dos primers (3’ e 5’). Ela inicia a reação sempre pela extremidade 3’ do primer, completando a fita simples daí em diante, sempre na direção do fragmento procurado.
Na Medicina, a técnica PCR é muito usada na eletroforese em gel agaroso, em que auxilia na detecção e subtipagem viral, detecção de mutação e polimorfismo genético, identificação de pessoas, entre outros.
Fonte: http://www3.fsa.br/localuser/Biologia/Profa.%20Cristina/Aula%20nova%20PCR.pdf http://www.dag.ufla.br/site/_adm/upload/file/Luciane%20Vilela%20Resende/PCR_2 http://www2.iq.usp.br/docente/goldberg/veterinaria2006/Aula_PCRvet_2006.pdf
